HPLC 法同时测定照山白浸膏片中金丝桃苷、槲皮素和山柰素的含量

王志轩 崔小丽 王世权 姚宝林    2018-07-10 23:11:06

承德市食品药品检验检测中心 河北承德 067000

[摘 要]目的 建立高效液相色谱法同时测定照山白浸膏片中金丝桃苷、槲皮素和山柰素含量的方法。方法 采用C18色谱柱;乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱;流速1.0ml/min;检测波长366nm。结果 金丝桃苷、槲皮素、山柰素分别在201.24~2012.36ng、21.09~210.92ng、12.57~125.71ng范围内线性关系良好;平均加样回收率分别为95.20%、96.64%、95.06%。结论 建立的方法简便、准确、重复性好,可用于照山白浸膏片的质量控制。

[关键词]照山白浸膏片;金丝桃苷;槲皮素;山柰素;HPLC

[中图分类号]R284 [文献标识码]A [文章编号]1674-9561(2018)02-002-02

照山白浸膏片是由7%照山白细粉和93%照山白经水煮的浸膏混合制成的片剂,为照山白单方制剂,其主要药用有效成分为挥发油类物质[1-2]、酚酸类物质[3]和黄酮类物质[4-6],其中又以金丝桃苷、槲皮素和山柰素等黄酮类物质含量较高。近些年的研究表明,金丝桃苷、槲皮素和山柰素具有抗炎镇痛、祛痰止咳、抗氧化等多种药效[7-9]。

照山白浸膏片的现行质量标准只有显微和理化鉴别,指标单一,专属性差,不能有效控制产品质量。目前,已有文献报道照山白浸膏片中金丝桃苷的含量测定方法[10],但未有同时测定其中金丝桃苷、槲皮素、山柰素含量的报道。本实验采用高效液相色谱法同时测定照山白浸膏片中三种黄酮类成分的含量,可以用来控制其质量。

1仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪;电子分析天平(METTLER TOLEDO XPE26DR)

1.2试药

对照品:金丝桃苷(批号111521-201507含量94.3%)、槲皮素(批号100081-201509含量98.1%)、山柰素(批号110861-201310含量93.2%),均购自中国食品药品检定研究院,供含量测定用;照山白浸膏片,共10批(承德燕峰药业有限责任公司);乙腈(色谱纯, Fisher Scientific,美国);甲醇(分析纯,天津市康科德科技有限公司);磷酸(分析纯,天津佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司);水为娃哈哈纯净水。

2方法与结果

2.1色谱条件

色 谱 柱 采 用 SHISEIDO CAPCELL PAK C18(4.6mm×250mm,5μm), 流 动 相:[乙 腈 为A,0.1%磷 酸 为B, 梯 度 洗 脱(0 ~ 13min,8%A;13 ~ 28min,8% → 21%A;28 ~ 46min,21%A;46~60min,21%→40%A;60~77min,40%A;77~80min,8%A),流速1.0ml/min,检测波长为366nm,进样量为10μl。

2.2溶液的配制

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取槲皮素对照品10.75mg、山柰素对照品11.24mg分别置于50mL的容量瓶中,加甲醇适量使溶解,定容至刻度,摇匀;精密称取金丝桃苷对照品10.67mg置50mL的容量瓶中,加甲醇适量使溶解,精密量取槲皮素对照品溶液5mL、山柰素对照品溶液3mL,置同一 50mL的容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,即得到金丝桃苷浓度为201.24μg/mL,槲皮素浓度为21.09μg/mL,山柰素浓度为12.57μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

取照山白浸膏片10片,去除糖衣,精密称定,研细,精密称取0.3g,置于锥形瓶内,精密加入70%乙醇20mL,称定重量,超声处理30min,用70%乙醇补足减失的重量,滤过,取续滤液用0.22μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。

2.3系统适应性试验

分别取上述两种溶液,按2.1项下色谱条件试验,结果见图1,结果表明在此条件下三种成分可以得到很好的分离,理论板数均不低于5000。

2.4线性关系考察

分别精密量取对照品混合溶液1.0,2.0,3.0,5.0,7.0,10.0mL至10mL容量瓶内,加甲醇定容至刻度,摇匀,得到系列浓度的对照品溶液,按2.1项下色谱条件进行测定,以峰面积为纵坐标,以进样量为横坐标,计算三种对照品的线性回归方程如下。

金丝桃苷Y=272254.96X-43327.37,r=0.9998,n=6

槲皮素Y=561992.72X-3045026.09,r=0.9993,n=6

山柰素Y=572272.42X-398303.86,r=0.9998,n=6

结 果 表 明, 金 丝 桃 苷、 槲 皮 素、 山 柰 素 分 别 在201.24~2012.36,21.09~210.92,12.57~125.71ng范围内线性关系良好。

2.5精密度试验

取2.2.1项下溶液,按2.1项下色谱条件,重复进样6次,计算三种成分的峰面积RSD分别为0.20%,0.14%,0.10%,结果表明仪器的精密度良好。

2.6重复性试验

取照山白浸膏片6份,每份0.3g,按2.2.2项下的制备方法制备,按2.1方法测定,测得其中金丝桃苷、槲皮素、山柰素的平均含量分别为8.51、0.63、0.13(mg/g),RSD分别为0.10%,0.62%,0.62%,结果表明重复性良好。

2.7稳定性试验

取照山白浸膏片供试品溶液分别于0、2、6、12、24、48h进样,计算三种成分的RSD分别为0.51%,0.40%,0.42%,结果表明在48h内稳定。

2.8回收率试验

精密称取照山白浸膏片9份,每份约0.15g,分别加入一定量的对照品溶液,按2.2.2项下方法制备,按2.1项下条件检测,计算三种成分的回收率,结果见表1~表3。

2.9供试品含量测定

取10批不同批号照山白浸膏片,每批各3份,按2.2.2项下方法制备,按2.1项下色谱条件测定,外标法计算,结果见表4。

3讨论

3.1流动相选择

照山白浸膏片中成分较为复杂,为达到较好的分离效果,实验中曾选择过不同比例的甲醇(或乙腈)与0.1%磷酸(或冰醋酸溶液)作为流动相,其中以乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱分离效果最为良好,故选择该流动相体系。

3.2提取方法选择

在供试品制备时分别考察了不同的提取溶剂,结果发现70%乙醇提取效果较好,又考察了不同的提取方法,结果发现超声提取即可提取完全;同时对超声处理的时间进行了考察,发现超声处理30分钟即可提取完全。

3.3检测波长选择

分别取三种对照品溶液,在200~400nm范围内进行光谱扫描。结果表明金丝桃苷在361nm波长处有最大吸收,槲皮素在371nm波长处有最大吸收,山柰素在366nm波长处有最大吸收。综合考虑各吸收峰情况及杂质干扰选择366nm作为测定波长。

[参考文献]

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[3]夏重道,杜安全,王红萍,等.照山白有效成分的化学研究[J].中国药科大学学报,1999,30(4):314-315

[4]王先荣,杜安全,王红萍.照山白中黄酮醇类成分的提取分离和鉴定[J].安徽医药,1997,1(4):17-18

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[7]林萍,易宏伟,张斐.金丝桃苷药理作用研究进展[J].中国现代中药,2012,14(10):23-26

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[9]陈育华,周克元,袁汉尧.山奈酚药效的研究进展[J].广东医学,2010,31(8):1064-1066

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