青藤碱对脓毒血症模型大鼠 IL-2、IL-4 和 IL-10 的影响

王 凯 肖政辉*   2018-07-10 23:10:36

南华大学儿科医院(湖南省儿童医院)儿童重症医学科 湖南长沙 410000

[摘 要]目的 通过研究青藤碱(Alkaloid sinomenine,SIN)对脓毒血症大鼠的INF-γ、IL-2和IL-10的影响,探讨SIN在脓毒血症中的作用机制,为SIN在脓毒血症中抑制炎症反应作用提供实验依据。方法 选用近交系雄性Lewis大鼠作为研究对象,采用随机对照原则建立大鼠脓毒血症模型,将Lewis大鼠分为5组,每组8只。分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、低剂量青藤碱治疗组(L-SIN组)、中剂量青藤碱治疗组(M-SIN组)和高剂量青藤碱治疗组(H-SIN组)等5组,除了对照组,其他四组采用盲肠结扎穿孔术建立大鼠脓毒血症模型,其中L-SIN组、M-SIN组、H-SIN组在手术结束时立即分别给予青藤碱100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg进行尾静脉注射。术后24小时处死大鼠,采血测定血清IL-2、IL-4和IL-10水平,并对实验数据进行统计学分析。结果 1.5组大鼠术前精神状态良好,毛色光滑,反应迅速,进食、饮水正常。术后Sham组毛色光滑,精神状态良好,对外来刺激敏感,进食、饮水正常,未见寒战现象;而Model组、L-SIN组、M-SIN组和H-SIN组毛色不光滑,精神状态欠佳,饮水、进食减少,以Model组最明显,三组均不同程度上出现了寒战现象,尤以Model组和L-SIN组为甚;打开腹腔后,建模各组均出现程度不一的腹腔脓肿,以Model组为甚。2.H-SIN组和M-SIN组的IL-2均显著低于model组,而显著高于sham组(P<0.05)而L-SIN组与model组对比无统计学意义。3.H-SIN组IL-4、IL-10均显著低于model组,而显著高于sham组(P<0.05),而L-SIN组、M-SIN组分别与model组对比无统计学意义(P均<0.05)。结论 青藤碱有效降低脓毒血症中IL-2,而显著上调IL-4、IL-10的表达水平,调节TH1/TH2免疫平衡朝TH2发展,以抑制脓毒血症的炎症过度反应。

[关键词]青藤碱;脓毒血症;IL-2;IL-4;IL-10

[中图分类号]R699 [文献标识码]A [文章编号]1674-9561(2018)02-122-02

近年来,随着细菌耐药频频发生,人类抗生素的研发始终跟不上耐药菌产生的步伐,导致在临床上属于常见病的脓毒血症治疗效果不佳,一些患者甚至因为严重的感染丧失生命。在研发新型抗生素的同时,积极对传统中药进行创新再利用或许是改善脓毒血症结局的一个行之有效的手段。在T淋巴细胞中,Thl和Th2亚群是调节促炎/抗炎稳态的重要亚群[1],Thl细胞主要分泌INF-γ、IL-2及TNF-α等细胞因子,加剧机体炎性反应;Th2细胞则主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子,还可下调抗原递呈细胞及Thl细胞活性,抑制机体炎性反应[2]。有研究表明,从传统中药青风藤中提取的生物碱单体青藤碱(Sinomenine,SIN)具有免疫抑制、抗炎镇痛等多种药理作用[3],临床上被广泛应用于治疗类风湿性关节炎、风湿病等,获得了满意的疗效。本文拟建立一个大鼠脓毒血症模型,探讨SIN对大鼠脓毒血症的IL-2、IL-4和IL-10的影响,为SIN在脓毒血症中抑制炎症反应作用提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

近交系雄性Lewis大鼠购自南华大学动物实验研究所,6周龄大小,体重250-300g,购自南华大学清洁动物房。大鼠术前3天单独放入代谢笼,给予等级饲料喂养并自由饮水。

1.1.2实验用药物

盐酸青藤碱购自湖南正清制药有限公司,纯度大于95%。1.1.3主要试剂大鼠IL-2检测试剂盒、IL-4检测试剂盒及IL-10检测试剂盒均购自上海信裕生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1动物分组

采用随机对照原则,将Lewis大鼠分为5组,每组8只。分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、低剂量青藤碱治疗组(L-SIN组)、中剂量青藤碱治疗组(M-SIN组)和高剂量青藤碱治疗组(H-SIN组)等5组。

1.2.2建立脓毒血症模型。

1.3试验方法

造模前禁食12h,手术前予10%水合氯醛溶液按0.35ml/100g剂量进行腹腔注射麻醉,满意后,固定大鼠并常规腹部消毒、备皮和铺巾。沿腹中线切开皮肤约1.5cm,用镊探查到盲肠,将其用缝线结扎,被结扎盲肠头尾端用注射器针头刺穿人为造成穿孔,将盲肠内容物从穿孔部位挤压出后,连同盲肠和内容物送回腹腔,关腹。Sham组大鼠仅切开腹腔皮肤,对盲肠探查成功后即关腹,不结扎盲肠和造成穿孔。H-SIN组、M-SIN组、L-SIN组在手术结束时立即分别给予青藤碱100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg进行尾静脉注射。sham组及model组在术后尾静脉注射生理盐水0.5ml。术后大鼠即送入代谢笼,各种原因导致24h内死亡的大鼠均被剔除出组,重新补充大鼠继续观察。

1.4资料收集

术后24小时观察大鼠精神、毛色、尿量和进食情况并记录,处死大鼠,收集大鼠下腔静脉血液及肾脏组织,所取静脉血常温下放置1h,离心(3000r/min),留取上清液,均采用ELISA法,分别应用IL-2、IL-4和IL-10试剂盒,按说明书对上清液进行检测。

1.5统计学方法

采用SPSS19.0分析软件对数据进行处理,计量资料采用均数±标准差(χ±s)的形式表示,运用t值进行检验;计数资料采用χ2进行检验,P<0.05表示为数据差异有统计学意义。

2结果

2.1两组大鼠一般情况比较

5组大鼠术前精神状态良好,毛色光滑,反应迅速,进食、饮水正常。术后Sham组毛色光滑,精神状态良好,对外来刺激敏感,进食、饮水正常,未见寒战现象;而Model组、L-SIN组、M-SIN组和H-SIN组毛色不光滑,精神状态欠佳,饮水、进食减少,以Model组最明显,四组均不同程度上出现了寒战现象,model组全部出现寒战,L-SIN组7例出现寒战,M-SIN组4例出现寒战,而H-SIN组仅1例出现寒战。打开腹腔后,发现各组盲肠均出现粘连,model组及L-SIN组均出现脓肿,M-SIN组5例出现脓肿,H-SIN组有2例出现脓肿;各例小肠均不同程度充血、水肿;Sham组盲肠和毗邻器官无粘连,未见脓肿,小肠未见充血水肿等现象发生。

2.2血清相关检测比较

2.2.1大鼠血清IL-2比较

H-SIN组和M-SIN组均显著低于model组(P<0.05);L-SIN组和model组相比较,差异无显著性(P>0.05);H-SIN组、M-SIN组和L-SIN组分别和sham组进行比较,sham组显著低于SN各组(P<0.05);H-SIN组、M-SIN组进行组间比较,差异不具显著性(P>0.05)。见表1.

2.2.2大鼠血清IL-4、IL-10比较

H-SIN组、M-SIN组和L-SIN组均进行两两对比,差异有显著的性(P<0.05),且SIN各组IL-4、IL-10均显著高于model组(P<0.05);M-SIN组、L-SIN组均较sham组显著增高,但H-SIN组和sham组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1.

3讨论

脓毒血症其实质是全身性炎症呈恶性发展的状态,如不采取及时有效的阻断措施,容易发展为多器官功能衰竭(MODS)。最新文献表明,炎症介质在脓毒血症的发生发展中起关键作用,其血浆浓度与疾病的严重程度和预后明显相关[4]。青藤碱目前主要用于治疗治疗类风湿性关节炎及自身免疫性疾病,在临床上获得了肯定的疗效。文献报道[5]青藤碱可以降低CIA大鼠IFN-γ、IL-6、IL-1β水平,减轻全身炎症反应。文娟[6]发现SIN能改善临床症状和减少炎性病灶,SIN上调中枢神经系统内TGF-β1的表达,并指出这可能是青藤碱发挥其保护作用的机制之一。王竹等[7]发现青藤碱可抑制DC2.4细胞的生物学活性,减少DC的炎症因子分泌。可见,青藤碱的抗炎作用也是多通道的。

Th1和Th2亚群都由Th0细胞分化而来,Th1/Th2及其分泌的细胞因子能相互调节,维持体内Th1/Th2细胞的平衡。TH1细胞分泌的IL-2,与IL-21联合诱导可促进NK细胞增殖[8]。IL-2在机体内能够介导特异性免疫应答,在一定程度上体现了机体免疫的应答能力[9]。IL-4是Th2分泌的特征性细胞因子之一,可促进细胞内IgE的合成和分泌,是抗原引起炎症细胞活化聚集的基础[10]。IL-4可以诱导T细胞向Th2细胞发展,使前体细胞分化为Th2效应细胞。而IL-10主要由TH2细胞和单核巨噬细胞产生,能够抑制活化的T细胞产生细胞因子,从而抑制细胞免疫应答,还能抑制NK细胞活性,干扰NK细胞和巨噬细胞产生细胞因子,刺激B细胞分化增殖,促进抗体生成。因此,具有显著的抗炎和免疫抑制作用。在本研究中,较高浓度青藤碱治疗后的大鼠,其IL-2均显著低于脓毒血症组,而低浓度青藤碱却不能显著降低IL-2,提示一定浓度下,青藤碱能有效降低IL-2的表达。而经青藤碱处理的大鼠IL-4、IL-10均较脓毒血症组显著增加,且随着青藤碱浓度增加,IL-4、IL-10均呈现上升趋势,至400mg/kg可以发现,该浓度下IL-4、IL-10与假手术组无差异,提示青藤碱在合适浓度下能有效提升IL-4、IL-10的表达水平。

综上,青藤碱用于治疗脓毒血症时,可有效降低IL-2水平,同时提高IL-4、IL-10,调节机体免疫朝TH2方向倾斜,具有显著的抗炎效果。[参考文献]

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[2]Cabrera-Perez J, Condotta SA, Badovinac VP, et al. Impact of sepsis on CD4+T cell immunity[J]. J Leukoc Biol,2014,96(5):767-777.

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[6]文娟.青藤碱对大鼠EAE的防治作用及IL-10、TGF-β1表达的影响[D].长沙:中南大学,2008.

[7]王竹,王冰冰,官菊梅,等.青藤碱抑制体外培养DC2.4树突状细胞的生物学活性并减少炎症因子分泌[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(5):660-663.

[8]武海英,马军,孙佳,等.IL-2联合IL-21对人外周血NK细胞的诱导作用[J].广东医学,2018(02):192-194+198.

[9]尹成敏,时庆康.早期补充维生素D对早产儿免疫球蛋白和IL-2的影响[J].中国生化药物杂志,2014,34(9):157-159.

[10]马伟慧,卢贺敏,叶乐平.全氟辛酸暴露对哮喘小鼠炎症介质IL-4和IFN-γ及糖皮质激素受体的影响[J].中国病理生理杂志,2018,34(02):352-357.

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